丙戊酸钠通过EGFR下调CD44表达抑制胶质瘤细胞生长

目的:探讨丙戊酸钠通过抑制A172胶质瘤细胞表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的活化，下调CD44表达，进而调节细胞生长的机制。方法:实时荧光定量PCR和Western blot检测A172胶质瘤细胞中CD44以及siRNA下调CD44表达的情况，MTT检测CD44和丙戊酸钠对细胞生长的影响，Western blot检测丙戊酸钠对细胞中p-EGFR、EGFR和CD44表达影响。结果:丙戊酸钠抑制A172胶质瘤细胞生长，并具有浓度依赖性。A172胶质瘤细胞表达CD44，siRNA下调CD44表达后，细胞生长较正常组显著减缓。活化EGFR促进A172胶质瘤CD44蛋白表达，而EGFR的抑制剂Lapatinib可显著抑制上述效应。丙戊酸钠抑制EGFR磷酸化，下调CD44蛋白表达。结论:丙戊酸钠抑制A172胶质瘤细胞的生长。抑制A172胶质瘤细胞中EGFR的活化，下调CD44的表达，是丙戊酸钠抑制胶质瘤细胞生长的其中一个机制。     

CD20 和CD19 双靶点CAR-T细胞对B淋巴细胞肿瘤的杀伤作用

目的：设计同时靶向B淋巴细胞表面CD20 和CD19 两个抗原蛋白的双特异嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）并制备BiCAR-T 细胞，检测其对B淋巴细胞肿瘤细胞的杀伤作用以及对免疫缺陷B-NSG 小鼠白血病模型的治疗效果。方法：构建基于鼠源CD19 和人源化CD20 scFv 的双靶点CAR分子，将CAR基因装载于慢病毒载体中，在293T细胞中包装慢病毒，感染健康人T 细胞制备BiCAR-T 细胞。构建表达CD19 和CD20 的K562-CD19-GFP、K562-CD20-GFP 以及表达Luciferase 的Nalm6-Luc-GFP 细胞作为靶细胞，将BiCAR-T 细胞与靶细胞共同孵育，检测其对靶细胞杀伤能力及释放IFN-γ 水平。使用Nalm6-Luc-GFP 细胞构建白血病小鼠模型，尾静脉注射BiCAR-T细胞，通过小动物成像方法观察BiCAR-T细胞对荷瘤小鼠的治疗作用。结果：健康人来源的BiCAR-T 细胞经7 d 培养后扩增良好，扩增倍数为20~50 倍，阳性率为10%~92%，显示成功制备BiCAR-T细胞。在效靶比为10∶1 时，BiCAR-T细胞对Nalm-6、K562-CD19-GFP 和K562-CD20-GFP 的杀伤率显著高于对照组细胞[ （76.7±7.4）% vs（8.7±2.4）%、（93.3±5.2）% vs（46.7±6.2）、（51.0±0.8）vs（30.7±0.5）%，均P<0.01]；与对照组相比，与Nalm-6细胞共孵育后BiCAR-T 细胞分泌IFN- γ 量显著增加[（872.7±7.7）vs（101.0±5.3）pg/ml ，P<0.01]。动物实验表明，BiCAR-T细胞对B-NSG小鼠白血病模型治疗效果明显，注射BiCAR-T细胞后白血病细胞逐渐减少，第50 天时基本消失，小鼠全部存活至第70 天被安乐死；PBS和对照T细胞组小鼠分别在（19±3）和（20±1）d 全部死亡。结论：成功设计了表达CD19 和CD20 的双靶点CAR分子后成功制备了BiCAR-T 细胞，该细胞能够有效杀伤表达CD19 和/或CD20 的B淋巴细胞肿瘤细胞，与靶细胞共同孵育后能够分泌大量IFN-γ，对B-NSG免疫缺陷小鼠白血病模型具有明显的治疗效果。     

艳山姜挥发油通过调控巨噬细胞CD36和ABCA1表达抑制泡沫细胞的形成

目的:观察艳山姜挥发油对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞的抑制作用,并探索其机制。方法:使用佛波酯(PMA,100μg·L^-1)诱导人白血病单核细胞(THP-1)24 h后形成巨噬细胞,实验分为4组,分别为空白组(无血清RPMI 1640),模型组(80 mg·L^-1ox-LDL),艳山姜挥发油低剂量组(80 mg·L^-1ox-LDL+4μg·L^-1艳山姜挥发油),艳山姜挥发油高剂量组(80 g·L^-1ox-LDL+20μg·L^-1艳山姜挥发油)。噻唑蓝(MTT)比色法检测艳山姜挥发油对巨噬细胞的活性的影响,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测巨噬细胞中白细胞分化抗原36(CD36)和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测巨噬细胞内胆固醇酯含量,油红O染色法检测巨噬细胞中脂质小滴的含量。结果:艳山姜挥发油对巨噬细胞无毒性。与空白组比较,模型组的巨噬细胞内脂滴和胆固醇酯的含量显著增加(P<0.01),CD36蛋白表达显著上升(P<0.01),ABCA1蛋白表达无显著变化;与模型组比较,艳山姜挥发油显著抑制巨噬细胞中脂滴和胆固醇酯的含量(P<0.01),下调CD36的蛋白表达(P<0.01),上调ABCA1蛋白的表达(P<0.01),艳山姜挥发油可抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化。结论:艳山姜挥发油对ox-LDL诱导的巨噬细胞向泡沫细胞的形成具有抑制作用,该药理作用与艳山姜挥发油下调巨噬细胞CD36和上调ABCA1蛋白的表达有关。     

多发性骨髓瘤患者浆细胞免疫表型特点及其临床意义研究

目的：观察多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓中浆细胞免疫表型特点，及其与患者临床预后的相关性。方法：收集35例MM患者资料，骨髓涂片及切片分别经瑞氏-吉姆萨和HE染色后，观察分析骨髓细胞形态及病理学特点。同时，取患者骨髓或外周血分别进行流式细胞术检测及相关实验室检查。结果：MM患者骨髓浆细胞不仅数量明显增多，且形态明显异常，切片中浆细胞分布类型包括塞实型16例（45.71%），结节型14例（40.00%）和间质型5例（14.29%）。MM患者中出现血清LDH、β2-MG、Cr和BUN等检测指标升高的比例分别占80%、85.71%、62.86%和60%。MM患者浆细胞CD38、CD138均呈阳性表达，CD56、CD200、CD117和CD28阳性患者比例分别为65.71%、94.29%、60%和54.29%，CD20、CD81、CD33、CD27及CD13阳性患者比例分别为37.14%、42.86%、28.57%、57.14%和34.29%，而CD19及CD45阳性患者比例分别为22.86%和31.42%，且Igκ或Igλ链表达缺失呈单克隆增生。其中CD27和CD28的表达情况与MM患者预后密切相关，浆细胞CD27表达缺失及CD28阳性表达的患者5年总生存率较低（P < 0.05）。结论：MM患者骨髓中浆细胞免疫表型明显异常，其中CD27和CD28的表达与患者病情进展和临床预后具有显著相关性，因此免疫表型检测在MM患者临床诊断、治疗监测中具有重要意义。     

Ad-CD40L mobilizes CD4 T cells for the treatment of brainstem tumors

BackgroundDiffuse midline glioma, formerly DIPG (diffuse intrinsic pontine glioma), is the deadliest pediatric brainstem tumor with median survival of less than one year. Here, we investigated (i) whether direct delivery of adenovirus-expressing cluster of differentiation (CD)40 ligand (Ad-CD40L) to brainstem tumors would induce immune-mediated tumor clearance and (ii) if so, whether therapy would be associated with a manageable toxicity due to immune-mediated inflammation in the brainstem.MethodsSyngeneic gliomas in the brainstems of immunocompetent mice were treated with Ad-CD40L and survival, toxicity, and immune profiles determined. A clinically translatable vector, whose replication would be tightly restricted to tumor cells, rAd-Δ24-CD40L, was tested in human patient–derived diffuse midline gliomas and immunocompetent models.ResultsExpression of Ad-CD40L restricted to brainstem gliomas by pre-infection induced complete rejection, associated with immune cell infiltration, of which CD4+ T cells were critical for therapy. Direct intratumoral injection of Ad-CD40L into established brainstem tumors improved survival and induced some complete cures but with some acute toxicity. RNA-sequencing analysis showed that Ad-CD40L therapy induced neuroinflammatory immune responses associated with interleukin (IL)-6, IL-1β, and tumor necrosis factor α. Therefore, to generate a vector whose replication, and transgene expression, would be tightly restricted to tumor cells, we constructed rAd-Δ24-CD40L, the backbone of which has already entered clinical trials for diffuse midline gliomas. Direct intratumoral injection of rAd-Δ24-CD40L, with systemic blockade of IL-6 and IL-1β, generated significant numbers of cures with readily manageable toxicity.ConclusionsVirus-mediated delivery of CD40L has the potential to be effective in treating diffuse midline gliomas without obligatory neuroinflammation-associated toxicity.